LAPTM5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404229-ACT

LAPTM5 (lysosomal protein transmembrane 5) è una proteina di membrana lisosomiale/endosomiale arricchita nelle cellule ematopoietiche che regola il traffico intracellulare e l’attenuazione dei segnali nelle cellule immunitarie. Partecipa al trasporto mediato da vescicole e al turnover dipendente dai lisosomi di componenti della segnalazione, contribuendo a modellare vie prossimali al recettore come la segnalazione del recettore dell’antigene, le risposte alle citochine e la degradazione dipendente dall’ubiquitina. Grazie ai suoi ruoli nell’organizzazione endolisosomiale e nell’omeostasi della segnalazione immunitaria, LAPTM5 è rilevante per studi sull’attivazione dei leucociti, la regolazione dell’infiammazione e i programmi di segnalazione deregolati osservati in diversi contesti di malattie ematologiche. La sua espressione e funzione sono inoltre sfruttate per indagare come il traffico legato ai lisosomi influenzi le decisioni sul destino cellulare e la proteostasi nelle linee cellulari immunitarie.

LAPTM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LAPTM5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LAPTM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LAPTM5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LAPTM5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LAPTM5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LAPTM5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LAPTM5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LAPTM5 nelle cellule tumorali con espressione di LAPTM5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.