LAMP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400120-ACT

La glicoproteina di membrana associata ai lisosomi 1 (LAMP1) è una proteina transmembrana di tipo I altamente abbondante della membrana limitante lisosomiale, che contribuisce a mantenere l’integrità del lisosoma e supporta la dinamica di fusione delle vescicole. Partecipa al traffico endo-lisosomiale, alla lisofagia e al flusso autofagico, influenzando le vie di degradazione e riciclo del carico che intersecano la segnalazione di mTOR e le risposte allo stress. Il posizionamento dei lisosomi e la stabilità di membrana mediati da LAMP1 modulano inoltre l’esocitosi e il processamento dell’antigene nelle cellule immunitarie, collegando la biologia dei lisosomi alla segnalazione infiammatoria. Un’espressione deregolata di LAMP1 e l’alterazione della funzione lisosomiale sono associate a neurodegenerazione, interazioni ospite–patogeno legate alle infezioni e adattamento delle cellule tumorali allo stress metabolico, rendendola un nodo utile per l’analisi a livello di vie di segnalazione.

LAMP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LAMP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LAMP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LAMP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LAMP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LAMP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LAMP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LAMP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LAMP1 nelle cellule tumorali con espressione di LAMP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.