Lamellipodin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403034-ACT

RAPH1 codifica la lamellipodina, un adattatore associato a Ena/VASP e all’actina che collega la segnalazione dei fosfoinositidi al rimodellamento del citoscheletro in corrispondenza di lamellipodi e increspature di membrana (membrane ruffles). Interagendo con membrane arricchite in PI(3,4)P2/PI(3,4,5)P3 e con regolatori dell’actina, la lamellipodina sostiene le dinamiche di protrusione guidate da Rac, lo spreading cellulare e la migrazione direzionale, collegandosi a vie che coordinano il turnover delle adesioni e l’endocitosi. Un’espressione alterata di RAPH1 o programmi di motilità dipendenti dalla lamellipodina sono stati associati a fenotipi invasivi e a un rimodellamento tissutale deregolato in contesti rilevanti per la malattia, rendendola un nodo utile per studiare reti di segnalazione incentrate sulla migrazione nelle cellule umane. Queste funzioni vengono spesso analizzate in modelli di disseminazione delle cellule tumorali, processi di neurosviluppo e traffico delle cellule immunitarie, senza implicare esiti clinici.

Lamellipodin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAPH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Lamellipodin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAPH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAPH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Lamellipodin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAPH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Lamellipodin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Lamellipodin nelle cellule tumorali con espressione di RAPH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.