L-Myc Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401836-ACT

MYCL codifica L-Myc, un fattore di trascrizione della famiglia MYC con dominio basic helix–loop–helix leucine zipper, che forma eterodimeri con MAX per regolare la trascrizione dipendente dall’RNA polimerasi II. L-Myc modula programmi che controllano la progressione del ciclo cellulare, la biogenesi dei ribosomi, l’adattamento metabolico e la differenziazione associata alla linea cellulare, integrando segnali provenienti da vie di crescita e da vie sensibili allo stress. L’attività deregolata di MYCL e l’amplificazione del numero di copie sono state collegate a stati trascrizionali oncogenici, in particolare nella biologia dei tumori neuroendocrini e associati al carcinoma a piccole cellule, dove un’alterazione dell’equilibrio della rete MYC può rimodellare proliferazione e apoptosi. In quanto regolatore dipendente dal contesto, MYCL viene spesso studiato per analizzare l’espressione genica guidata da MYC/MAX, il controllo epigenetico dell’attività di promotori/enhancer e i fenotipi di “dipendenza trascrizionale” in sistemi modello.

L-Myc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MYCL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

L-Myc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MYCL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MYCL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di L-Myc. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MYCL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da L-Myc nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via L-Myc nelle cellule tumorali con espressione di MYCL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.