KMO Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418366-ACT

La KMO umana (chinurenina 3-monoossigenasi) è un enzima mitocondriale flavina-dipendente della via della chinurenina nel catabolismo del triptofano, che catalizza la conversione della L-chinurenina in 3-idrossichinurenina. Controllando il flusso verso metaboliti a valle come l’acido 3-idrossiantranilico e l’acido chinolinico, la KMO influenza l’equilibrio redox cellulare, la biosintesi del NAD+ e la segnalazione neuro-immunitaria. Un’alterazione dell’attività della KMO può modificare i livelli di metaboliti neuroattivi e ossidativi, collegando questa via a processi associati all’infiammazione e a meccanismi di malattie neurologiche. L’espressione della KMO viene inoltre studiata in contesti di stress metabolico e di regolazione immunitaria, in cui il rimodellamento della via della chinurenina incide sulle transizioni dello stato cellulare.

KMO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KMO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KMO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KMO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KMO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KMO. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KMO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KMO nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KMO nelle cellule tumorali con espressione di KMO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.