JHDM1D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405142-ACT

KDM7A (nota anche come JHDM1D) codifica una demetilasi degli istoni contenente il dominio Jumonji C che modula l’accessibilità della cromatina rimuovendo segni repressivi di metilazione su residui di lisina dell’istone H3, plasmando così i programmi trascrizionali. Attraverso la regolazione epigenetica, JHDM1D influenza processi quali la specificazione del destino cellulare, l’espressione genica associata alle linee cellulari e il coordinamento di reti trascrizionali coinvolte nello sviluppo e nella risposta allo stress. Dinamiche deregolate della metilazione degli istoni che coinvolgono KDM7A sono state implicate in stati trascrizionali aberranti pertinenti alla trasformazione oncogenica e a fenotipi del neurosviluppo, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul controllo genico guidato dalla cromatina. La sua attività si interseca con vie epigenetiche più ampie che collegano lo stato delle modificazioni degli istoni alla trascrizione dipendente dalla RNA polimerasi II e al mantenimento dell’identità cellulare.

JHDM1D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KDM7A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

JHDM1D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KDM7A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KDM7A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di JHDM1D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KDM7A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da JHDM1D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via JHDM1D nelle cellule tumorali con espressione di KDM7A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.