IRSp53 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403072-ACT

BAIAP2 codifica IRSp53, una proteina adattatrice che collega la percezione della curvatura di membrana al rimodellamento del citoscheletro di actina attraverso interazioni con le GTPasi della famiglia Rho, come Cdc42, con partner di legame del dominio SH3 e con complessi regolatori dell’actina. IRSp53 contribuisce alla formazione di filopodi e lamellipodi, coordinando processi quali la migrazione cellulare, la dinamica dell’adesione e la crescita dei neuriti. Grazie al suo ruolo nell’organizzazione del citoscheletro e nel traffico di membrana, l’attività di BAIAP2 si interseca con reti di segnalazione che regolano la morfologia epiteliale e neuronale. In studi meccanicistici, alterazioni della dinamica dell’actina dipendente da IRSp53 sono state associate a fenotipi di neurosviluppo e a cambiamenti della motilità cellulare associati ai tumori.

IRSp53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BAIAP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IRSp53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BAIAP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BAIAP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IRSp53. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BAIAP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IRSp53 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IRSp53 nelle cellule tumorali con espressione di BAIAP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.