IRF3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417171-ACT

Il fattore regolatore dell’interferone 3 (IRF3) è un fattore di trascrizione espresso in modo ubiquo che funge da hub centrale dell’immunità antivirale innata. In seguito al rilevamento di DNA o RNA citosolico, IRF3 viene attivato a valle delle vie dei recettori di riconoscimento dei pattern, tra cui cGAS–STING e RIG-I/MDA5–MAVS; in questo contesto, la fosforilazione mediata da TBK1/IKKε promuove la dimerizzazione di IRF3, la traslocazione nel nucleo e l’induzione degli interferoni di tipo I e dei geni stimolati dagli interferoni. IRF3 interagisce inoltre con la segnalazione di NF-κB, con l’apoptosi e con programmi di citochine infiammatorie, plasmando le risposte cellulo-intrinseche a patogeni e stress cellulare. Un’attività deregolata di IRF3 è stata implicata nelle firme interferoniche aberranti osservate in modelli di malattie infettive, in fenotipi autoinfiammatori e nelle interazioni tra tumore e sistema immunitario, rendendolo un nodo chiave per studi meccanicistici della regolazione immunitaria.

IRF3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IRF3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IRF3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IRF3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IRF3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IRF3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IRF3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IRF3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IRF3 nelle cellule tumorali con espressione di IRF3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.