Ini1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423027-ACT

Il gene murino **Smarcb1** codifica **Ini1** (noto anche come **SNF5/BAF47**), una subunità centrale del complesso di rimodellamento della cromatina **SWI/SNF (BAF)** ATP-dipendente, che regola il posizionamento dei nucleosomi e programmi trascrizionali che controllano la progressione del ciclo cellulare, la specificazione di linea e la differenziazione. Ini1 contribuisce a coordinare l’accessibilità di enhancer e promotori, integrando segnali a monte con lo stato della cromatina per modulare reti di espressione genica coinvolte nello sviluppo e nelle risposte al danno al DNA. L’alterazione della funzione di **SMARCB1/INI1** è associata a una regolazione epigenetica modificata e a una proliferazione aberrante, e la perdita di subunità di SWI/SNF è una caratteristica ricorrente in molteplici tipi di tumore. In quanto regolatore centrale della cromatina, Smarcb1 è spesso studiato in vie che governano l’equilibrio tra repressione e attivazione trascrizionale, il controllo dei checkpoint e l’architettura della cromatina.

Ini1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Smarcb1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ini1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Smarcb1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Smarcb1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ini1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Smarcb1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ini1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ini1 nelle cellule tumorali con espressione di Smarcb1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.