ING4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403707-ACT

ING4 (inhibitor of growth family member 4) codifica una proteina nucleare con caratteristiche di soppressore tumorale che funge da regolatore della trascrizione associato alla cromatina. ING4 partecipa a complessi legati all’acetilazione degli istoni e influenza programmi di espressione genica che governano il controllo del ciclo cellulare, l’apoptosi, le risposte al danno del DNA e la senescenza cellulare, con un cross-talk documentato con la segnalazione di p53 e NF-κB. Modulando gli output trascrizionali infiammatori e le vie sensibili allo stress, ING4 contribuisce a limitare la proliferazione aberrante e a regolare le risposte allo stress genotossico e ossidativo. Alterazioni dell’espressione o della funzione di ING4 sono state associate a fenotipi oncogeni e a una segnalazione infiammatoria deregolata in molteplici contesti rilevanti per il cancro, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul controllo epigenetico.

ING4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ING4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ING4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ING4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ING4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ING4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ING4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ING4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ING4 nelle cellule tumorali con espressione di ING4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.