Id4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401380-ACT

ID4 (inhibitor of DNA binding 4) codifica un regolatore trascrizionale di tipo elica–ansa–elica (HLH) privo di un dominio basico di legame al DNA e modula l’espressione genica sequestrando le E-proteins e altri fattori bHLH. Attraverso queste interazioni, Id4 influenza l’impegno di linea, la differenziazione e il controllo del ciclo cellulare, collegando i programmi trascrizionali dello sviluppo a segnali provenienti dalla cromatina e dalle vie di segnalazione. L’attività di ID4 è stata associata a processi quali la neurogenesi, lo sviluppo gliale e la differenziazione epiteliale, dove può determinare l’equilibrio tra stati proliferativi e differenziati. Un’espressione deregolata di ID4 è stata riportata in molteplici contesti associati a patologie, incluse alterazioni epigenetiche rilevanti per il cancro e fenotipi di differenziazione aberrante, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul controllo trascrizionale.

Id4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ID4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Id4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ID4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ID4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Id4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ID4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Id4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Id4 nelle cellule tumorali con espressione di ID4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.