HYAL4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409245-ACT

L’HYAL4 umano codifica un enzima della famiglia delle ialuronidasi coinvolto nel ricambio dei glicosaminoglicani della matrice extracellulare, influenzando il rimodellamento di microambienti ricchi di ialuronano. Modulando la composizione della matrice pericellulare, HYAL4 può influire sulle interazioni cellula–matrice, sulla migrazione e sugli output di segnalazione legati all’adesione e alle risposte infiammatorie. Alterazioni del metabolismo dell’ialuronano sono state associate a fibrosi tissutale, dinamiche tumore–stroma e traffico delle cellule immunitarie, rendendo l’espressione di HYAL4 una variabile rilevante nei modelli di malattia. Studiare la regolazione e la funzione di HYAL4 aiuta a chiarire come il catabolismo dei glicani si integri con l’omeostasi della matrice extracellulare e con il comportamento cellulare.

HYAL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HYAL4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HYAL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HYAL4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HYAL4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HYAL4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HYAL4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HYAL4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HYAL4 nelle cellule tumorali con espressione di HYAL4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.