HoxD10 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403328-ACT

HOXD10 codifica il fattore di trascrizione homeobox HoxD10, un regolatore chiave della patterning antero–posteriore e della morfogenesi degli arti, che contribuisce a stabilire l’identità cellulare attraverso il legame al DNA in modo specifico per sequenza e il controllo trascrizionale. Nei tessuti differenziati, HOXD10 partecipa a programmi che regolano la migrazione e l’adesione cellulare e il rimodellamento della matrice extracellulare, interfacciandosi con reti trascrizionali dello sviluppo e vie di segnalazione che modellano l’impegno di linea. Un’alterata espressione di HOXD10 o una deregolazione dei suoi elementi regolatori è stata associata a fenotipi oncogeni, inclusi cambiamenti nell’invasività e nel potenziale metastatico, riflettendo il suo ruolo nel controllo di insiemi di geni legati alle dinamiche epitelio–mesenchimali. In quanto regolatore dello sviluppo con attività dipendente dal contesto, HOXD10 è spesso utilizzato per studiare i circuiti trascrizionali, la regolazione della cromatina e stati di espressione genica rilevanti per la malattia in modelli cellulari umani.

HoxD10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HOXD10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HoxD10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HOXD10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HOXD10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HoxD10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HOXD10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HoxD10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HoxD10 nelle cellule tumorali con espressione di HOXD10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.