HIF PHD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403671-ACT

EGLN3 codifica la prolil-idrossilasi 3 di HIF (PHD3), una diossigenasi sensibile all’ossigeno che idrossila le subunità HIF-α, favorendone, in condizioni di normossia, l’ubiquitinazione dipendente da VHL e la successiva degradazione proteasomiale. Modulando l’output trascrizionale di HIF, PHD3 influenza l’adattamento cellulare all’ipossia, inclusi il metabolismo glicolitico, la segnalazione angiogenica, i programmi legati all’eritropoiesi e le risposte allo stress ossidativo. L’espressione di EGLN3 è regolata dinamicamente dall’ipossia e da altri segnali di stress, collegandola al controllo a feedback all’interno della via di HIF e a reti più ampie di omeostasi redox e mitocondriale. L’attività deregolata di EGLN3/PHD3 e la segnalazione di HIF sono spesso studiate nel contesto della biologia tumorale, dello stress tissutale associato a ischemia, dell’infiammazione e dei processi neurodegenerativi, in cui il rimodellamento trascrizionale dipendente dall’ossigeno è un determinante chiave del fenotipo.

HIF PHD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EGLN3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HIF PHD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EGLN3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EGLN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HIF PHD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EGLN3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HIF PHD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HIF PHD3 nelle cellule tumorali con espressione di EGLN3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.