Plásmido CRISPR de Activación (h) HES4: sc-408938-ACT

El HES4 humano codifica un represor transcripcional de tipo hélice-bucle-hélice básica (bHLH) de la familia Hairy/Enhancer-of-split, que actúa como efector aguas abajo de la señalización canónica de Notch. Al unirse a motivos similares a E-box y reclutar complejos correpresores, HES4 modula programas transcripcionales que controlan decisiones de destino celular, el momento de la diferenciación y el mantenimiento de estados tipo progenitor. La actividad de HES4 se asocia con procesos del desarrollo y de especificación de linaje, e interactúa con vías que regulan la “stemness” y la diferenciación, por lo que es relevante para estudios del control transcripcional desregulado en cáncer y otros trastornos proliferativos. Dado que las alteraciones del eje Notch–HES pueden desviar trayectorias de diferenciación y modificar la capacidad proliferativa, HES4 se investiga con frecuencia como un regulador dependiente del contexto de redes de expresión génica.

HES4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HES4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HES4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HES4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HES4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HES4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HES4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HES4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HES4 en células tumorales con expresión de HES4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.