HES4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408938-ACT

HES4 umano codifica un repressore trascrizionale di tipo basic helix–loop–helix (bHLH) della famiglia Hairy/Enhancer-of-split, che funziona come effettore a valle della segnalazione canonica Notch. Legandosi a motivi simili alle E-box e reclutando complessi di corepressori, HES4 modula programmi trascrizionali che controllano le decisioni sul destino cellulare, la tempistica della differenziazione e il mantenimento di stati simili a quelli dei progenitori. L’attività di HES4 è associata a processi di sviluppo e di specificazione di linea cellulare e interseca vie che regolano “stemness” e differenziazione, rendendola rilevante per studi sul controllo trascrizionale deregolato nel cancro e in altri disturbi proliferativi. Poiché le perturbazioni dell’asse Notch–HES possono spostare le traiettorie di differenziazione e alterare la capacità proliferativa, HES4 è spesso oggetto di indagine come regolatore dipendente dal contesto delle reti di espressione genica.

HES4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HES4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HES4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HES4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HES4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HES4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HES4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HES4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HES4 nelle cellule tumorali con espressione di HES4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.