HERG Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401143-ACT

KCNH2 codifica il canale del potassio umano HERG (Kv11.1) voltaggio-dipendente, un determinante fondamentale della corrente rettificante ritardata rapida che modella la ripolarizzazione del potenziale d’azione cardiaco. Il gating del canale e la sua espressione sulla superficie cellulare si integrano con i programmi di eccitabilità di membrana e sono modulati da vie di segnalazione che influenzano fosforilazione, traffico intracellulare e proteostasi nelle cellule eccitabili. Alterazioni genetiche e funzionali di KCNH2 sono fortemente associate alle sindromi del QT lungo, sia ereditarie sia acquisite, e alla suscettibilità aritmogena, rendendolo un nodo chiave per lo studio dell’elettrofisiologia, della regolazione dei canali ionici e dei meccanismi di cardiotossicità. Al di là del contesto cardiaco, l’attività di HERG viene impiegata per indagare stati cellulari dipendenti dai canali ionici, in cui la conduttanza del potassio influisce su proliferazione, risposte allo stress e segnalazione bioelettrica.

HERG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HERG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HERG. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HERG nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HERG nelle cellule tumorali con espressione di KCNH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.