GSC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404148-ACT

GSC umano (goosecoid homeobox) codifica un fattore di trascrizione con homeodominio che regola la strutturazione precoce dell’embrione e la specificazione del mesendoderma controllando programmi di espressione genica legati alle decisioni di destino cellulare e alla morfogenesi tissutale. GSC partecipa a reti trascrizionali dello sviluppo che si integrano con vie di segnalazione come TGF-β/SMAD e WNT/β-catenina, influenzando la transizione epitelio-mesenchimale, la migrazione e gli stati di differenziamento. Un’espressione deregolata di GSC è stata associata ad alterazioni della regolazione dei geni dello sviluppo ed è stata studiata in contesti che includono la plasticità delle cellule tumorali e fenotipi invasivi, rendendolo rilevante per indagare il controllo trascrizionale dell’identità di linea. In quanto proteina nucleare legante il DNA, GSC è comunemente utilizzato come marcatore e regolatore in modelli di sviluppo precoce, differenziamento di cellule staminali e riprogrammazione trascrizionale associata alla EMT.

GSC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GSC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GSC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GSC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GSC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GSC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GSC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GSC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GSC nelle cellule tumorali con espressione di GSC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.