GRK 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403415-ACT

La GRK3 umana (G protein-coupled receptor kinase 3, ADRBK2) è una chinasi serina/treonina che fosforila i GPCR attivati per promuovere il reclutamento della β-arrestina, la desensibilizzazione del recettore e il traffico endocitico. Modulando l’ampiezza e la durata del segnale dei GPCR, GRK3 influenza vie a valle tra cui la segnalazione cAMP/PKA, PLC–PKC e MAPK/ERK, con effetti ampi sulla risposta cellulare a ormoni, neurotrasmettitori e chemochine. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di GRK3 sono state collegate a programmi di segnalazione recettoriale disregolati rilevanti per la regolazione dell’infiammazione, la trasmissione neurologica e fenotipi oncogenici, rendendola un nodo utile per analizzare il controllo delle vie dei GPCR. Gli studi su GRK3 si concentrano comunemente sul bias specifico del recettore, sulla regolazione tramite feedback e sul cross-talk tra la segnalazione mediata da proteine G e quella mediata da β-arrestina.

GRK 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRK 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRK 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRK 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRK 3 nelle cellule tumorali con espressione di GRK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.