gremlin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401244-ACT

GREM1 codifica per gremlin-1, una glicoproteina secreta che agisce come antagonista extracellulare delle proteine morfogenetiche dell’osso (BMP2, BMP4 e BMP7), modulando la segnalazione della superfamiglia BMP/TGF-β durante lo sviluppo e nell’omeostasi dei tessuti adulti. Regolando la disponibilità dei ligandi, gremlin-1 influenza le decisioni sul destino cellulare, le interazioni epitelio–mesenchimali e programmi di rimodellamento quali proliferazione, differenziamento e fibrosi. Un’espressione deregolata di GREM1 è stata associata ad alterazioni del crosstalk stroma–epitelio, a una deposizione anomala della matrice e a segnali microambientali pro-tumorigeni in diversi contesti patologici, inclusi i disturbi fibrotici e vie correlate al cancro. Queste caratteristiche rendono GREM1 un bersaglio utile per studi meccanicistici sul controllo della via BMP e sulle reti di segnalazione extracellulare.

gremlin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GREM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

gremlin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GREM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GREM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di gremlin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GREM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da gremlin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via gremlin-1 nelle cellule tumorali con espressione di GREM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.