golgin 97 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403152-ACT

GOLGA1 codifica la golgina 97, una proteina periferica di membrana a coiled-coil arricchita nella rete trans-Golgi (TGN), che contribuisce a mantenere l’architettura del Golgi e supporta l’ancoraggio (tethering) delle vescicole durante il traffico post-Golgi. Coordinando lo smistamento del carico e le vie di trasporto retrogrado tra Golgi, endosomi e membrana plasmatica, la golgina 97 contribuisce all’omeostasi delle membrane e alla corretta organizzazione della via secretoria. L’alterazione dei fattori di tethering e di traffico del Golgi è associata a un riciclo recettoriale modificato, a risposte allo stress e alla mislocalizzazione degli enzimi di glicosilazione, processi spesso studiati nella neurodegenerazione, nella biologia delle infezioni e nei fenotipi delle cellule tumorali. In quanto marcatore e regolatore della dinamica del TGN, la golgina 97 è comunemente analizzata in saggi sulla struttura degli organelli, sulla cinetica del trasporto vescicolare e sulla proteostasi in condizioni di stress cellulare.

golgin 97 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GOLGA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

golgin 97 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GOLGA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GOLGA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di golgin 97. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GOLGA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da golgin 97 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via golgin 97 nelle cellule tumorali con espressione di GOLGA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.