GluR-5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402475-ACT

GRIK1 codifica la subunità GluR-5 (GluK1) del recettore ionotropico del glutammato di tipo kainato, un canale cationico attivato da ligando che contribuisce alla rapida neurotrasmissione eccitatoria nel sistema nervoso centrale. I recettori contenenti GluR-5 modulano la forza sinaptica e l’eccitabilità neuronale attraverso i flussi di sodio e calcio, plasmando l’attività di rete e la plasticità in vie coinvolte nell’apprendimento, nell’elaborazione sensoriale e nella segnalazione del dolore. L’attività recettoriale si integra con cascate di segnalazione calcio-dipendenti e programmi trascrizionali regolati dall’attività che influenzano lo sviluppo e il rimodellamento delle sinapsi. Un’alterata segnalazione dei recettori del kainato e l’espressione di GRIK1 sono state associate a fenotipi neuropsichiatrici e neurologici, a supporto del suo impiego come bersaglio meccanicistico per studiare l’equilibrio eccitatorio/inibitorio e la disfunzione dei circuiti.

GluR-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRIK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GluR-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRIK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRIK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GluR-5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRIK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GluR-5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GluR-5 nelle cellule tumorali con espressione di GRIK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.