GLUD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402187-ACT

Il gene umano **GLUD1** codifica la glutammato deidrogenasi mitocondriale 1, un enzima NAD(P)+-dipendente che catalizza la deaminazione ossidativa reversibile del glutammato in **α-chetoglutarato** e ammoniaca, collegando il catabolismo degli amminoacidi al ciclo dell’acido citrico (ciclo di Krebs/TCA). Regolando l’equilibrio tra l’utilizzo del glutammato e il flusso anaplerotico, GLUD1 influenza la bioenergetica cellulare, l’omeostasi redox e il metabolismo dell’azoto, con effetti a valle sui pool di neurotrasmettitori e sull’accoppiamento metabolico. L’attività di GLUD1 si interfaccia con vie che controllano la funzione mitocondriale e la segnalazione metabolica, e una regolazione alterata è stata associata a disturbi che coinvolgono la gestione degli amminoacidi e la disregolazione metabolica neuroendocrina. Queste caratteristiche rendono GLUD1 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sul metabolismo mitocondriale e su fenotipi cellulari dipendenti dal glutammato.

GLUD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLUD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GLUD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLUD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLUD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GLUD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLUD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GLUD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GLUD1 nelle cellule tumorali con espressione di GLUD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.