GalNAc-T6 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431525-ACT

Galnt6 codifica la polipeptide N-acetilgalattosaminiltransferasi 6 (GalNAc-T6), un enzima iniziatore della O-glicosilazione di tipo mucinico residente nel Golgi, che trasferisce GalNAc ai residui Ser/Thr su proteine secrete e di membrana. Stabilendo siti di O-glicano sulle mucine e su altre glicoproteine, GalNAc-T6 influenza il ripiegamento proteico, la suscettibilità alle proteasi, l’organizzazione dei recettori e le interazioni con la matrice extracellulare che modellano adesione cellulare, motilità e trasduzione del segnale. Pattern alterati di O-glicosilazione sono spesso collegati al rimodellamento epiteliale e a microambienti infiammatori, rendendo Galnt6 un nodo rilevante per studiare la regolazione del glicoproteoma in contesti associati alla malattia. Nei modelli murini, la modulazione dell’attività di Galnt6 può essere utilizzata per indagare in che modo l’avvio della O-glicosilazione influisca sull’omeostasi tissutale e sulla responsività delle vie di segnalazione.

GalNAc-T6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Galnt6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GalNAc-T6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Galnt6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Galnt6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GalNAc-T6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Galnt6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GalNAc-T6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GalNAc-T6 nelle cellule tumorali con espressione di Galnt6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.