Plásmido CRISPR de Activación (h) GABARAPL1: sc-403288-ACT

GABARAPL1 (proteína 1 similar a la proteína asociada al receptor GABA tipo A) es un modificador tipo ubiquitina de la familia ATG8 que se conjuga a la fosfatidiletanolamina para favorecer la formación de autofagosomas, el reclutamiento de carga y la fusión autofagosoma–lisosoma. Participa en programas de autofagia selectiva, incluida la mitofagia y la agrefagia, y contribuye al tráfico intracelular y a la homeostasis de orgánulos mediante interacciones con adaptadores que contienen el motivo LIR. Al modular la proteostasis y las respuestas al estrés, GABARAPL1 influye en redes de señalización vinculadas al sensado de nutrientes y al control de calidad celular, incluidas vías coordinadas con mTOR y la función lisosomal. La alteración de la expresión de GABARAPL1 o del flujo autofágico se ha asociado con fenotipos relevantes para la neurodegeneración, la supervivencia de células cancerosas y el estrés cardiometabólico, lo que la hace útil para estudios mecanísticos de la proteostasis asociada a enfermedad.

GABARAPL1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GABARAPL1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GABARAPL1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GABARAPL1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GABARAPL1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GABARAPL1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GABARAPL1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GABARAPL1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GABARAPL1 en células tumorales con expresión de GABARAPL1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.