GABARAPL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403288-ACT

GABARAPL1 (GABA type A receptor-associated protein-like 1) è un modificatore ubiquitina-like della famiglia ATG8 che si coniuga alla fosfatidiletanolammina per sostenere la formazione dell’autofagosoma, il reclutamento del carico e la fusione autofagosoma–lisosoma. Partecipa a programmi di autofagia selettiva, inclusi mitofagia e aggreofagia, e contribuisce al traffico intracellulare e all’omeostasi degli organelli attraverso interazioni con adattatori contenenti il motivo LIR. Modellando la proteostasi e le risposte allo stress, GABARAPL1 influenza reti di segnalazione legate al sensing dei nutrienti e al controllo di qualità cellulare, incluse vie coordinate con mTOR e con la funzione lisosomiale. Alterazioni dell’espressione di GABARAPL1 o del flusso autofagico sono state associate a fenotipi rilevanti per la neurodegenerazione, la sopravvivenza delle cellule tumorali e lo stress cardiometabolico, rendendolo utile per studi meccanicistici sulla proteostasi associata a malattia.

GABARAPL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GABARAPL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GABARAPL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GABARAPL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GABARAPL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GABARAPL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GABARAPL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GABARAPL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GABARAPL1 nelle cellule tumorali con espressione di GABARAPL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.