FPR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418173-ACT

Il recettore 1 per i peptidi formilati (FPR1) codifica FPR, un GPCR a sette domini transmembrana che riconosce peptidi N-formilati derivati da batteri e da mitocondri danneggiati, consentendo una rapida chemiotassi di neutrofili e monociti. FPR1 si accoppia principalmente a proteine Gi per attivare PLCβ, il flusso di Ca2+ intracellulare, PI3K/AKT e la segnalazione MAPK, coordinando il rimodellamento dell’actina, l’attivazione delle integrine, la degranulazione e la generazione di specie reattive dell’ossigeno. Attraverso queste vie, FPR1 contribuisce alla sorveglianza immunitaria innata e al microambiente infiammatorio nei siti di infezione o di danno tissutale sterile. La deregolazione della segnalazione di FPR1 è stata studiata in condizioni infiammatorie croniche e nell’infiammazione associata ai tumori, dove il reclutamento e l’attivazione alterati dei leucociti possono influenzare la biologia della malattia.

FPR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FPR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FPR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FPR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FPR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FPR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FPR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FPR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FPR nelle cellule tumorali con espressione di FPR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.