FOXE3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404466-ACT

FOXE3 (forkhead box E3) codifica un fattore di trascrizione forkhead/winged-helix che regola programmi di espressione genica necessari per lo sviluppo oculare, in particolare la formazione della placode del cristallino, il mantenimento dell’epitelio del cristallino e la differenziazione. Attraverso il legame al DNA in modo sequenza-specifico, FOXE3 coordina reti trascrizionali che influenzano il controllo del ciclo cellulare, l’identità epiteliale e l’impegno di linea nelle strutture del segmento anteriore. La disregolazione della funzione di FOXE3 e le varianti genetiche sono associate a disturbi oculari congeniti, tra cui disgenesia del segmento anteriore, microftalmia e fenotipi associati alla cataratta, rendendolo un bersaglio rilevante per lo studio del controllo trascrizionale nello sviluppo. FOXE3 è quindi ampiamente utilizzato come strumento molecolare per modellare la biologia del cristallino e per mappare i regolatori a monte e gli effettori a valle della segnalazione mediata dai fattori forkhead.

FOXE3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXE3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FOXE3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXE3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXE3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FOXE3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXE3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FOXE3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FOXE3 nelle cellule tumorali con espressione di FOXE3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.