FMR1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401919-ACT

FMR1 codifica la fragile X mental retardation protein (FMRP), una proteina legante l’RNA che regola il trasporto degli mRNA, la loro stabilità e la repressione della traduzione a livello delle sinapsi e in altri compartimenti neuronali. FMRP modula la sintesi proteica dipendente dall’attività attraverso interazioni con complessi ribonucleoproteici e vie di segnalazione che plasmano la plasticità sinaptica, inclusa la traduzione dipendente dai mGluR e programmi più ampi di sviluppo neuronale. La disregolazione dell’espressione o della funzione di FMR1 è associata a disturbi correlati all’X fragile e a fenotipi del neurosviluppo, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studiare il controllo post-trascrizionale nel cervello. In cellule coltivate e sistemi modello, FMR1 viene comunemente studiato per mappare i bersagli RNA, definire reti di controllo della traduzione e indagare i meccanismi dell’espressione genica responsiva all’attività.

FMR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FMR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FMR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FMR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FMR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FMR1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FMR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FMR1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FMR1 nelle cellule tumorali con espressione di FMR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.