FLIP_S/L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400400-ACT

CFLAR codifica la proteina cellulare inibitrice di FLICE (FLIP), espressa nelle isoforme FLIP_S e FLIP_L che modulano l’apoptosi e la necroptosi avviate dai recettori di morte. Interagendo con FADD e la procaspasi-8 nel complesso di segnalazione induttore di morte, FLIP regola finemente l’attivazione della caspasi-8 e, di conseguenza, influenza gli esiti delle vie di segnalazione di TNF, Fas/CD95 e TRAIL, oltre alla segnalazione a valle di NF-κB. Attraverso questo ruolo regolatorio, CFLAR incide sulle decisioni di sopravvivenza cellulare, sulla segnalazione infiammatoria e sull’omeostasi immunitaria. Un’alterata espressione di CFLAR/FLIP è stata associata a una deregolazione della resistenza all’apoptosi e a patologie immuno-correlate, rendendolo un nodo di interesse comune negli studi sulla sopravvivenza delle cellule tumorali, sulle risposte alle infezioni e sulla segnalazione di stress guidata dalle citochine.

FLIPS/L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CFLAR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FLIPS/L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CFLAR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CFLAR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FLIPS/L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CFLAR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FLIPS/L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FLIPS/L nelle cellule tumorali con espressione di CFLAR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.