FLG/Filaggrin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400644-ACT

FLG codifica la filaggrina, una proteina ricca di istidina prodotta durante la differenziazione terminale dei cheratinociti, essenziale per la formazione della barriera epidermica. La processazione della profilaggrina genera monomeri di filaggrina che aggregano i filamenti intermedi di cheratina, promuovono l’assemblaggio dell’involucro cornificato e sostengono l’architettura dello strato corneo, collegando FLG ai programmi di cheratinizzazione e differenziazione epidermica. La successiva degradazione della filaggrina contribuisce ai componenti del fattore naturale di idratazione (NMF), che regolano l’idratazione e il pH dello strato corneo, influenzando l’attività delle proteasi e le difese innate. La perdita di funzione o la ridotta espressione di FLG è fortemente associata a disfunzione della barriera e a una maggiore suscettibilità a fenotipi cutanei infiammatori, rendendo FLG un bersaglio chiave per lo studio dell’omeostasi epiteliale e delle risposte allo stress.

FLG/Filaggrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FLG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FLG/Filaggrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FLG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FLG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FLG/Filaggrin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FLG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FLG/Filaggrin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FLG/Filaggrin nelle cellule tumorali con espressione di FLG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.