Fibulin-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401978-ACT

EFEMP1 codifica a fibulina-3, uma glicoproteína secretada da matriz extracelular que se associa a fibras elásticas e a componentes da membrana basal para regular a organização da matriz, a adesão célula–matriz e a remodelação tecidual. A fibulina-3 influencia redes de sinalização ligadas à homeostase da matriz extracelular, incluindo a modulação da atividade de proteases e a comunicação cruzada com vias como TGF-β e VEGF, que moldam a angiogênese, a fibrose e respostas ao estresse. Alterações na expressão de EFEMP1 têm sido relatadas em diferentes contextos relacionados à integridade da retina e à degeneração macular, bem como à remodelação do estroma associada a tumores, reforçando sua relevância para estudos de regulação do microambiente. Essas propriedades tornam EFEMP1 um alvo útil para investigar a dinâmica da matriz extracelular, as interações epitélio–mesênquima e a proteostase associada à secreção.

Fibulin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EFEMP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Fibulin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EFEMP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EFEMP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Fibulin-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EFEMP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Fibulin-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Fibulin-3 em células tumorais com expressão de EFEMP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.