FEN-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403168-ACT

Il gene umano **FEN1** codifica la flap endonucleasi 1 (FEN-1), una nucleasi specifica per la struttura essenziale per il processamento degli intermedi a “flap” 5′ durante la maturazione dei frammenti di Okazaki e la riparazione per escissione di basi a long-patch. FEN-1 coordina la propria attività con PCNA, la DNA polimerasi δ/ε e la DNA ligasi I per mantenere la progressione della forcella replicativa e l’integrità del genoma, e contribuisce alla stabilità dei telomeri e alla risoluzione di strutture di replicazione bloccate. Un’attività o un’espressione deregolata di FEN1 è associata a stress replicativo, instabilità cromosomica e alterazioni della segnalazione della risposta al danno del DNA, rendendola rilevante negli studi sulla mutagenesi e sui difetti di mantenimento del genoma associati al cancro. In quanto nodo centrale nella replicazione e riparazione del DNA, FEN-1 è spesso analizzata nei percorsi che regolano i checkpoint del ciclo cellulare, la scelta della via di riparazione e i meccanismi di resistenza a perturbazioni genotossiche.

FEN-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FEN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FEN-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FEN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FEN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FEN-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FEN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FEN-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FEN-1 nelle cellule tumorali con espressione di FEN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.