FAM20A Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431579-ACT

Fam20a codifica FAM20A, una proteina della via secretoria localizzata nell’apparato di Golgi che agisce come pseudochinasi e partner regolatorio della chinasi FAM20C, influenzando la fosforilazione di proteine extracellulari e secrete. Attraverso questo ruolo, FAM20A contribuisce a coordinare la processazione proteica e i programmi legati alla mineralizzazione nei tessuti associati a smalto e osso, collegando il traffico del Golgi alla maturazione della matrice extracellulare. L’alterazione dell’attività di FAM20A è stata associata a difetti nella biomineralizzazione e a fenotipi di calcificazione ectopica, rendendola rilevante per studi di biologia scheletrica e sviluppo dentale. Nei sistemi murini, Fam20a rappresenta quindi uno strumento utile per indagare il controllo, da parte della via secretoria, della fosforilazione delle proteine extracellulari e dell’omeostasi della matrice.

FAM20A Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fam20a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAM20A Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fam20a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fam20a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAM20A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fam20a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAM20A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAM20A nelle cellule tumorali con espressione di Fam20a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.