FAM195A Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-426985-ACT

Fam195a codifica la proteina murina FAM195A, un fattore ancora scarsamente caratterizzato, con evidenze emergenti di un coinvolgimento nella segnalazione intracellulare e in programmi cellulari di risposta allo stress, sulla base dell’architettura di domini conservati e dei profili di espressione. Le evidenze disponibili suggeriscono un ruolo nella regolazione dell’omeostasi proteica e di processi associati alle membrane, che possono influenzare la crescita cellulare, la differenziazione e l’adattamento a segnali/metacues metabolici. Un’alterata attività delle vie che governano la proteostasi e la segnalazione da stress è ampiamente rilevante per fenotipi che interessano il mantenimento dei tessuti e la funzione immunitaria o lo sviluppo neurobiologico, rendendo Fam195a un locus utile per studi meccanicistici. Poiché le annotazioni funzionali restano limitate, una modulazione controllata dell’espressione endogena di Fam195a può aiutare a definire le reti trascrizionali a valle e le dipendenze di via.

FAM195A Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fam195a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAM195A Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fam195a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fam195a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAM195A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fam195a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAM195A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAM195A nelle cellule tumorali con espressione di Fam195a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.