EVA1B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412477-ACT

EVA1B (nota anche come FAM176B) codifica una proteina transmembrana localizzata principalmente sulle membrane intracellulari, dove è stata associata alla regolazione del traffico vescicolare, di processi legati all’autofagia e della segnalazione per la sopravvivenza cellulare. Studi recenti suggeriscono che EVA1B influenzi vie di risposta allo stress che modellano l’omeostasi cellulare, con effetti dipendenti dal contesto su proliferazione e programmi infiammatori. Un’espressione alterata di EVA1B è stata riportata in diversi contesti rilevanti per la malattia, incluse variazioni trascrizionali associate al cancro e fenotipi immuno-correlati, supportandone l’impiego come nodo meccanicistico per l’analisi delle vie di segnalazione. In modelli cellulari umani, la modulazione di EVA1B offre un approccio per chiarire come la segnalazione associata alle membrane si interfacci con la dinamica degli organelli e con l’adattamento trascrizionale.

EVA1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EVA1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EVA1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EVA1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EVA1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EVA1B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EVA1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EVA1B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EVA1B nelle cellule tumorali con espressione di EVA1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.