ETBR Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420112-ACT

Ednrb codifica il recettore dell’endotelina di tipo B (ETBR), un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) che lega le endoteline per regolare la segnalazione vasomotoria, lo sviluppo delle cellule derivate dalla cresta neurale e la biologia dei melanociti e del sistema nervoso enterico. L’attivazione di ETBR coinvolge vie canoniche dei GPCR, tra cui la mobilizzazione di Ca2+ mediata da Gq/PLCβ e la segnalazione MAPK, modulando migrazione cellulare, differenziamento e patterning tissutale. Nei modelli murini, la funzione di Ednrb è strettamente legata alla specificazione delle linee cellulari della cresta neurale e alla formazione del sistema nervoso periferico; alterazioni sono associate ad aganglionosi e difetti di pigmentazione. Queste caratteristiche rendono ETBR un nodo rilevante per lo studio della segnalazione nello sviluppo, della comunicazione cellula-cellula e del crosstalk della via dell’endotelina in contesti fisiologici e rilevanti per la malattia.

ETBR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ednrb senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ETBR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ednrb nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ednrb, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ETBR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ednrb nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ETBR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ETBR nelle cellule tumorali con espressione di Ednrb silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.