ERBIN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402637-ACT

ERBIN (proteina interagente con ERBB2) è una proteina scaffold contenente un dominio PDZ che si localizza alle membrane basolaterali e coordina l’assemblaggio dei complessi recettoriali, il traffico intracellulare e l’instradamento dei segnali. Modula l’output della via ERBB2/EGFR e interseca le cascate MAPK e PI3K organizzando nodi di segnalazione prossimali alla membrana e collegando i recettori agli effettori a valle. ERBIN influenza inoltre la polarità epiteliale e l’organizzazione delle giunzioni tramite interazioni con regolatori della polarità e dell’adesione, plasmando l’architettura cellulare e la fedeltà della segnalazione. Un’espressione deregolata di ERBIN o un’alterazione della sua funzione di scaffold è stata associata a una segnalazione anomala dei fattori di crescita e a difetti di polarità, rilevanti per studi meccanicistici in oncologia e in altre patologie epiteliali.

ERBIN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ERBIN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERBIN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ERBIN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ERBIN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERBIN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ERBIN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERBIN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERBIN nelle cellule tumorali con espressione di ERBIN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.