eIF4AII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402758-ACT

EIF4A2 codifica eIF4AII, un’elicasi dell’RNA di tipo DEAD-box che funge da componente centrale del macchinario di inizio della traduzione eIF4F. Svolgendo le strutture secondarie nelle 5′ UTR e coordinando il caricamento dell’mRNA sui ribosomi, eIF4AII sostiene la traduzione cap-dipendente e modella l’output del proteoma in risposta a segnali cellulari di crescita e di stress. La sua attività è collegata a vie che controllano la sintesi proteica, il metabolismo dell’RNA e la riprogrammazione traduttiva adattativa allo stress, processi spesso perturbati nella biologia delle malattie proliferative e associate allo stress. L’alterato controllo della traduzione mediato dai membri della famiglia eIF4A è stato sfruttato per studiare come una traduzione dell’mRNA deregolata contribuisca alla segnalazione oncogenica, alla neurobiologia e alle interazioni virus–ospite, senza implicare esiti clinici.

eIF4AII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF4A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF4AII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF4A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF4A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF4AII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF4A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF4AII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF4AII nelle cellule tumorali con espressione di EIF4A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.