EDEM3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408476-ACT

EDEM3 (ER degradation enhancing alpha-mannosidase-like protein 3) è un componente residente del reticolo endoplasmatico (RE) del controllo qualità delle glicoproteine, che partecipa alla degradazione associata al RE (ERAD) promuovendo il riconoscimento e la rimozione delle N-glicoproteine mal ripiegate in modo dipendente dalla demannosilazione. Influenzando la risposta alle proteine non ripiegate (UPR), la proteostasi e la fedeltà della via secretoria, EDEM3 contribuisce a regolare l’adattamento cellulare allo stress e il turnover delle proteine “client” aberranti. L’alterazione dell’ERAD e della proteostasi del RE è ampiamente rilevante per la biologia delle malattie, inclusi contesti in cui stress cronico del RE, processazione dei glicani alterata e degradazione proteica deregolata contribuiscono alla patogenesi. EDEM3 umano è quindi un nodo utile per studiare i circuiti di controllo qualità del RE e l’omeostasi della via secretoria in flussi di lavoro di genomica funzionale e meccanicistica.

EDEM3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EDEM3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EDEM3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EDEM3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EDEM3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EDEM3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EDEM3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EDEM3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EDEM3 nelle cellule tumorali con espressione di EDEM3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.