Edc4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403803-ACT

L’EDC4 umano codifica Edc4, un’impalcatura conservata dei corpi di processamento citoplasmatici (P-bodies) che coordina la rimozione del cappuccio (decapping) degli mRNA e la loro degradazione 5′–3′ organizzando fattori chiave come DCP1/DCP2 ed esonucleasi associate. Grazie al suo ruolo nella regolazione genica post-trascrizionale, Edc4 influenza il turnover degli mRNA, la repressione della traduzione e la dinamica dei granuli ribonucleoproteici sensibili allo stress. L’alterazione delle vie dei P-body e del decapping può rimodellare i programmi di stabilità dei trascritti che regolano proliferazione, differenziamento e segnalazione infiammatoria. La deregolazione del metabolismo dell’RNA e dell’attività del complesso di decapping è stata collegata a fenotipi oncogenici e neurobiologici, a supporto dell’uso di EDC4 come nodo per studiare l’omeostasi dell’RNA rilevante per la malattia.

Edc4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EDC4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Edc4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EDC4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EDC4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Edc4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EDC4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Edc4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Edc4 nelle cellule tumorali con espressione di EDC4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.