E2F1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400123-ACT

E2F1 (fattore di trascrizione E2F1) è un fattore di trascrizione specifico per sequenza che regola la transizione G1/S coordinando l’espressione dei geni necessari per la replicazione del DNA, il metabolismo dei nucleotidi e la progressione del ciclo cellulare. La sua attività è strettamente regolata dall’asse RB/E2F, che integra la segnalazione mitogenica con il controllo dei checkpoint, e interagisce con l’apoptosi dipendente da p53 e con le risposte al danno al DNA. Una deregolazione della segnalazione di E2F1 è spesso associata a proliferazione incontrollata, stress replicativo e instabilità genomica osservati in diversi tipi di cancro e in altri disturbi proliferativi. Poiché E2F1 può anche influenzare i programmi di apoptosi, senescenza e differenziamento, è ampiamente utilizzato per studiare decisioni di destino cellulare dipendenti dal contesto.

E2F1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di E2F1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

E2F1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus E2F1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione E2F1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di E2F1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus E2F1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da E2F1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via E2F1 nelle cellule tumorali con espressione di E2F1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.