DOR-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402195-ACT

OPRD1 codifica il recettore oppioide delta umano (DOR-1), un GPCR di classe A che si accoppia principalmente alle proteine Gi/Go per regolare l’attività dell’adenilil ciclasi, la conduttanza dei canali ionici e la segnalazione MAPK. DOR-1 modula la trasmissione sinaptica e la comunicazione neuro-immune attraverso vie a valle come cAMP/PKA ed ERK1/2, plasmando l’eccitabilità neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori. L’attivazione del recettore influenza processi che includono la segnalazione nocicettiva, la responsività allo stress e i circuiti legati alla ricompensa; inoltre, in contesti di ricerca biomedica, alterazioni dell’espressione o della segnalazione di OPRD1 sono state associate a fenotipi neuropsichiatrici e correlati al dolore. Queste caratteristiche rendono OPRD1 un nodo utile per studiare la dinamica della segnalazione dei GPCR, il traffico/desensibilizzazione recettoriale e il bias di via in modelli cellulari umani.

DOR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OPRD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DOR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OPRD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OPRD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DOR-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OPRD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DOR-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DOR-1 nelle cellule tumorali con espressione di OPRD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.