DNAH3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410012-ACT

DNAH3 codifica la catena pesante 3 della dineina assonemale, un’ATPasi dipendente dai microtubuli che contribuisce alla motilità e all’integrità strutturale delle ciglia e dei flagelli assonemali. Come parte del macchinario dei bracci di dineina, DNAH3 sostiene la generazione e il coordinamento del battito ciliare all’interno della via cilium/assonema, influenzando il flusso dei fluidi e la segnalazione meccanosensoriale nei tessuti ciliati. L’alterazione dei componenti della dineina assonemale è ampiamente associata a fenotipi legati alle ciliopatie, inclusi difetti di lateralità e infertilità maschile, e una funzione ciliare alterata può intersecarsi con programmi di segnalazione dello sviluppo come Hedgehog. Queste caratteristiche rendono DNAH3 un bersaglio utile per analizzare processi guidati dalle ciglia, dinamiche del citoscheletro e relazioni genotipo–fenotipo in modelli cellulari umani.

DNAH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNAH3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNAH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNAH3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNAH3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNAH3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNAH3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNAH3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNAH3 nelle cellule tumorali con espressione di DNAH3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.