DNA pol α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402762-ACT

POLA1 codifica la subunità catalitica della DNA polimerasi alfa umana (DNA pol α), una polimerasi associata alla primasi essenziale per avviare la replicazione del DNA cromosomico, estendendo i primer RNA–DNA sintetizzati alle origini di replicazione e sul filamento lento. Questa attività colloca POLA1 al centro del programma di inizio della replicazione, coordinandosi con il licensing delle origini e l’assemblaggio del replisoma per sostenere la progressione della fase S e la stabilità del genoma. Alterazioni della funzione della DNA pol α possono favorire stress replicativo, dinamiche anomale della forcella di replicazione e conseguenti risposte al danno al DNA che si intersecano con la segnalazione dei checkpoint e con le vie di mantenimento della cromatina. POLA1 è stata implicata in disturbi associati a difetti del metabolismo degli acidi nucleici e della segnalazione immunitaria, ed è spesso studiata nel contesto del controllo della proliferazione e dell’instabilità genomica associata alla replicazione.

DNA pol α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol α nelle cellule tumorali con espressione di POLA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.