dHAND Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402017-ACT

HAND2 (dHAND) codifica un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix che controlla la specificazione delle linee mesenchimali e la morfogenesi degli organi, con ruoli di primo piano nello sviluppo cardiaco, nei derivati della cresta neurale e nel patterning degli arti. dHAND integra reti di segnalazione dello sviluppo, tra cui BMP, WNT/β-catenina, NOTCH e SHH, per regolare programmi genici che governano proliferazione, migrazione e differenziamento. Nella biologia umana, un’espressione alterata di HAND2 o una disfunzione della sua regolazione è associata a cardiopatie congenite e a più ampie anomalie dello sviluppo; inoltre, il controllo trascrizionale deregolato è stato studiato in contesti di rimodellamento cardiaco e di biologia tumorale. Queste caratteristiche rendono HAND2 un nodo utile per analizzare i circuiti trascrizionali e le decisioni di destino cellulare in modelli cellulari e di organoidi pertinenti.

dHAND Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HAND2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

dHAND Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HAND2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HAND2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di dHAND. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HAND2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da dHAND nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via dHAND nelle cellule tumorali con espressione di HAND2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.