DDX60 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433350-ACT

Il gene murino Ddx60 codifica DDX60, un’elicasi dell’RNA della famiglia DExD/H-box inducibile dall’interferone, che funge da sensore citosolico e da regolatore dell’immunità innata antivirale. DDX60 partecipa al metabolismo dell’RNA e alle vie di riconoscimento dei pattern promuovendo la segnalazione dipendente da RIG-I/MDA5, amplificando le risposte di interferone di tipo I e sostenendo programmi di espressione degli ISG che limitano la replicazione virale. Attraverso interazioni con substrati di RNA e componenti della segnalazione immunitaria, DDX60 influenza le reti trascrizionali guidate da NF-κB e IRF e modella le risposte cellulari allo stress da RNA a doppio filamento. La disregolazione dell’attività di Ddx60 è quindi rilevante per studi sulla segnalazione infiammatoria, sulle interazioni ospite–patogeno e sui meccanismi di malattia associati all’immunità in modelli murini.

DDX60 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ddx60 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDX60 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ddx60 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ddx60, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDX60. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ddx60 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDX60 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDX60 nelle cellule tumorali con espressione di Ddx60 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.