DDIT3/CHOP/GADD153 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400051-ACT

DDIT3, noto anche come CHOP/GADD153, codifica un fattore di trascrizione bZIP inducibile dallo stress che integra segnali provenienti dalla risposta alle proteine non correttamente ripiegate (unfolded protein response) e dalla risposta integrata allo stress (integrated stress response). È fortemente indotto a valle dell’asse PERK–eIF2α–ATF4 durante lo stress del reticolo endoplasmatico e modula programmi trascrizionali che controllano apoptosi, autofagia, equilibrio redox e regolazione del ciclo cellulare. DDIT3 influenza gli esiti adattativi rispetto a quelli terminali dello stress alterando l’espressione di geni coinvolti nel ripiegamento proteico, nel metabolismo degli amminoacidi e nella funzione mitocondriale. Una segnalazione di DDIT3 deregolata è stata collegata alla sopravvivenza delle cellule tumorali sotto stress proteotossico, a fenotipi di stress metabolico e neurodegenerativo e a eventi di fusione oncogenica come FUS–DDIT3 nel liposarcoma mixoide.

DDIT3/CHOP/GADD153 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDIT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDIT3/CHOP/GADD153 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDIT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDIT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDIT3/CHOP/GADD153. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDIT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDIT3/CHOP/GADD153 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDIT3/CHOP/GADD153 nelle cellule tumorali con espressione di DDIT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.