DBC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403056-ACT

CCAR2 codifica Deleted in Breast Cancer 1 (DBC-1), una proteina regolatrice nucleare che modula i programmi trascrizionali interagendo con fattori associati alla cromatina e sensori metabolici. DBC-1 influenza la segnalazione dipendente dall’acetilazione attraverso la regolazione dell’attività delle sirtuine e coopera con recettori nucleari e co-regolatori trascrizionali per plasmare il controllo del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e l’espressione genica legata all’apoptosi. Attraverso queste funzioni, CCAR2/DBC-1 è collegato a vie che governano la stabilità del genoma e l’adattamento allo stress, risultando rilevante per studi sul rimodellamento trascrizionale associato ai tumori e sulla senescenza cellulare. Alterazioni dell’espressione di CCAR2 o delle reti di interazione di DBC-1 sono state riportate in diversi contesti oncologici e sono anche di interesse per indagare il crosstalk metabolico–epigenetico nelle cellule umane.

DBC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCAR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DBC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCAR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCAR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DBC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCAR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DBC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DBC-1 nelle cellule tumorali con espressione di CCAR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.