Dab2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400979-ACT

Disabled homolog 2 (DAB2) codifica Dab2, una proteina adattatrice dell’endocitosi che collega l’internalizzazione mediata dalla clatrina al traffico dei recettori e all’attenuazione del segnale. Dab2 partecipa a vie che regolano la segnalazione TGF-β, la modulazione di Wnt/β-catenina e l’adesione e migrazione cellulare dipendenti dalle integrine, organizzando complessi proteici in prossimità della membrana. Attraverso effetti sulla polarità epiteliale, sui programmi di differenziamento e sul turnover dei recettori per i fattori di crescita, un’espressione alterata di DAB2 è stata associata, in molteplici contesti tissutali, a fenotipi di progressione tumorale e a comportamenti cellulari legati alla metastasi. Dab2 contribuisce inoltre a processi più ampi di trasporto vescicolare che influenzano la capacità della cellula di rispondere a segnali extracellulari.

Dab2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DAB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dab2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DAB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DAB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dab2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DAB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dab2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dab2 nelle cellule tumorali con espressione di DAB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.