CTLA-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400948-ACT

Il gene umano **CTLA4** codifica per **CTLA-4 (CD152)**, un recettore inibitorio di checkpoint immunitario espresso prevalentemente sui linfociti T attivati e sui linfociti T regolatori, che limita l’attivazione dei T competendo con **CD28** per il legame a **CD80/CD86** sulle cellule presentanti l’antigene. Attraverso l’attenuazione della segnalazione co-stimolatoria, CTLA-4 modula vie a valle tra cui **PI3K–AKT**, **NF-κB** e **MAPK**, contribuendo a mantenere la tolleranza periferica e a limitare una produzione eccessiva di citochine. Un’espressione o una segnalazione di CTLA-4 deregolata è associata alla perdita dell’omeostasi immunitaria e a risposte linfocitarie alterate implicate in fenotipi autoimmuni e infiammatori. In quanto nodo chiave dei circuiti immunoregolatori, **CTLA4** è ampiamente studiato negli stati funzionali dei linfociti T, nelle dinamiche di attivazione guidate dall’antigene e nei meccanismi di soppressione immunitaria.

CTLA-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CTLA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CTLA-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CTLA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CTLA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CTLA-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CTLA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CTLA-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CTLA-4 nelle cellule tumorali con espressione di CTLA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.