CREST Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403134-ACT

SS18L1 (CREST) codifica un fattore associato alla cromatina, arricchito nei neuroni, che interagisce con la regolazione trascrizionale e con programmi di espressione genica dipendenti dall’attività. CREST coopera con i macchinari di rimodellamento della cromatina, inclusi complessi correlati a SWI/SNF, per modulare lo stato di promotori ed enhancer che influenzano la differenziazione neuronale, la crescita dei neuriti e la funzione sinaptica. Attraverso questi meccanismi epigenetici, SS18L1 collega la segnalazione neuronale a cambiamenti a lungo termine nelle reti trascrizionali e nell’identità cellulare. La disregolazione delle vie associate a CREST è stata studiata nel contesto di processi rilevanti per malattie del neurosviluppo e neurodegenerative, inclusi un’alterata omeostasi sinaptica e la trascrizione responsiva allo stress.

CREST Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SS18L1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CREST Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SS18L1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SS18L1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CREST. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SS18L1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CREST nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CREST nelle cellule tumorali con espressione di SS18L1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.